Качество подготовки образцов биологических материалов для цитологических исследований является обзательной предпосылкой адекватного результата этих исследований. Оно определяется правильнымвзятием образца биологического материала и приготовлением его препарата, а также качеством реагентов, применяемых для фиксации и окрашивания мазка. Настоящие методические указания содержат детальные описания процедур получения, хранения и доставки в лабораторию биологического материала в зависимости от его вида и способа получения. Четко сформулированы правила нанесения мазка, его фиксации и окраски. Рекомендованы фиксаторы и способы окрашивания мазков.Методические указания предназначены для клинического персонала, осуществляющего взятие образцов биоматериалов, и для работников клинических лабораторий, выполняющих цитологические исследования.
Организации - разработчики:
Ассоциация клинических цитологов России
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова
Авторы:
Доктор медицинских наук, профессор, заведующий Центральной цитологической лабораторией ЦКБ Департамента здравоохранения МПС РФ, Президент Ассоциации клинических цитологов России Н.А. Шапиро
Доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией клинической цитологии Российского онкологического научного центра РАМН, Вице-Президент Ассоциации клинических цитологов России В. Н. Богатырев
Доктор медицинских наук, профессор, консультант лаборатории клинической цитологии Российского онкологического научного центра РАМН А.С. Петрова
Доктор медицинских наук, заведующая Централизованной многопрофильной межрайонной клинико-диагностической лабораторией при поликлинике № 117 г. Москвы Н.Ю.Полонская
Кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической цитологии Российского онкологического научного центра РАМН В.К. Соколова
Кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической цитологии Российского онкологического научного центра РАМН О. В. Чистякова.
Кандидат медицинских наук, цитолог Федерального госудapcтвенного учреждения "Центральная клиническая больница Гражданской Авиации" И.В. Юрасова.
Доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией проблем клинико-лабораторной диагностики Научно-исследовательского центра ММА им. И.М. Сеченова, руководитель научно-методического центра по клинической лабораторной диагностике Минздрава России В.В. Меньшиков
Кандидат медицинских наук, врач клинической лабораторной диагностики лабораторного центра ММА им. И.М.Сеченова О.M. Пименова
Врач клинической лабораторной диагностики лабораторного центра ММА им. И.М. Сеченова О.Г. Кадашева
Введение
Согласно "Номенклатуре клинических лабораторных исследований, применяемых в целях диагностики болезней и слежения за состоянием пациентов в учреждениях здравоохранения Российской Федерации", утвержденной приказом Минздрава России от 21.02.2000 г. № 64 и "Примерному перечню лабораторных исследований для клинико-диагностических лабораторий лечебно-профилактических учреждений", утвержденному приказом Минздрава России от 25.12. 1997 г. № 380, цитологические исследования относятся к числу лабораторных тестов, выполнение которых предписано клинико-диагностическим лабо-раториям учреждений России. Правильность взятия образца материала является первичной предпосылкой адекватной морфологиче-ской оценки цитологического препарата. Объективную сложность для обеспечения необходимого качества препарата представляет различие мест взятия образца материала (различные органы и ткани), использование нескольких способов взятия образцов (соскоб, аспирация, пункция и т.п.), отличия характера биологическо-го материала (отделяемое и секреты различных органов, аспираты из полостей, пунктаты из опухолей и опухолеподобных образований, мазки-отпечатки, соскобы с поверхностей органов, с эрозий и разрезов удаленной ткани и т. д.). Существенные особенности процедур взятия образца материала с учетом специфи-ческих условий и требований должны быть детально и четко сформулированы, чтобы обеспечить правильность выполнения этих процедур клиническим персоналом, участвующим во взятии образцов - врачами клиницистами различных специальностей, заинтересованными в достоверной лабораторной информации относительно курируемых ими пациентов.
Описание метода
Принципиальное значение для обеспечения высокого качества препарата имеет соблюдение правил приготовления мазка, его фиксации и окраски. Неудовлетворительно приготовленные, плохо фиксированные и неправильно окрашенные мазки не должны подвергаться исследованию, так как в этих условиях невозможно получение лабораторной информации, заслуживающей доверия. В руководствах и периодической специальной литературе приведены разнообразные способы взятия биологического материала и подготовки препаратов для цитологических исследований. На основании обобщения и объективной оценки этих вариантов процедур в высококвалифицированных специализированных цитологических лабораториях, в ГОУВПО Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова совместно с соавторами методических указаний избраны, детально и четко описаны наиболее надежно обеспечивающие необходимое качество подготовки цитологических препаратов:
Правила взятия образца биологического материала применительно к месту и способу его взятия и характеру самого материала;
Правила доставки образца биоматериала в лабораторию;
Правила приготовления мазка;
Правила фиксации мазка;
Правила окрашивания мазка.
Показания к применению:для цитологических исследований с целью установления диагноза различных заболеваний. Противопоказаний нет.
Материально-техническое обеспечение: стандартное оборудование цитологической лаборатории.
Описание метода.
Цитологическое исследование является одним из основных методов морфологического анализа клеточного и неклеточного биологического материала. Оно состоит в качественной и количественной оценке характеристик морфологической структуры клеточных элементов в цитологическом препарате (мазке) с целью установления диагноза различных заболеваний доброкачественной или злокачественной опухоли и неопухолевых поражений.) В процессе цитологического исследования выделяют три этапа:
1. Взятие образца биологического материала (проводится клиническим персоналом).
2. Приготовление препарата (мазка) (проводится клиническим или лабораторным персоналом).
3. Собственно исследование препарата, включая просмотр и оценку морфологических особенностей клеток в мазке (проводится лабораторным персоналом).
Процедуры, свойственные каждому из этих этапов, имеют в равной степени существенное значение для окончательного морфологического заключения и должны выполняться в соответствии с правилами, надеж-но обеспечивающими наиболее точный результат исследования. Настоящие методические указания имеют целью установить единые правила обеспечения качества препаратов образцов биологического материала на этапах взятия образца материала и подготовки препарата, предназначенного для цитологического исследования.
Правила получения биологического материала для цитологического исследования.
Взятие материала для цитологических исследований проводит врач (с помощью медицинской сестры): врачи-клиницисты разного профиля (гинекологи, хирурги, онкологи, эндокринологи, врачи-эндоскописты). Время взятия материала и условия подготовки пациентов зависят от вида материала и способа его получения.
1.1.Виды исследуемых материалов:
Эксфолиативный материал:
отделяемое различных органов (молочная железа, влагалище, мочевой пузырь и др.); соскобы и отделяемое с поверхности эрозий, ран, язв, свищей; соскобы с шейки матки и цервикального канала, аспираты из полости матки; секреты желез, экскреты, мокрота, транссудаты, экссудаты, промывные воды и т.д.
Пункционный материал:
- пунктаты, полученные тонкой иглой (тонкоигольная биопсия) из опухолей, предопухолевых и опухолепо-добных образований и уплотнений различной локализации (кожа, молочная железа, легкие, средостение, печень, почки, забрюшинные образования, щитовидная железа, предстательная железа, яичко, яичники, лимфатические узлы, миндалины, слюнные железы, мягкие ткани, кости, и др.).
Биопсийный и операционный материал:
- материал, полученный при проведении хирургических вмешательств (мазки-отпечатки, соскобы со свежего разреза удаленной ткани, жидкость);
- материал, полученный при проведении эндоскопического исследования (ларингоскопии, бронхоскопии, эзофагоскопии, гастроскопии, дуоденоскопии, лапароскопии, колоноскопии и т.д.).
1.2. Способы получения материала для цитологического исследования
1.2.1.Общие положения:
- Клеточный материал наносят сухим инструментом тонким слоем в продольном направлении (или готовят отпечатки с ткани) на чисто вымытые, обезжиренные 96% спиртом и натертые досуха предметные стекла или помещают в среду накопления ("жидкостная" цитология).
- Емкости для доставки материала: пробирки, чашки Петри и т.д. должны быть чистыми, после обработки в сухожаровом шкафу. Подсушивание цитологических мазков проводят при комнатной температуре на воздухе.
- Если методика окрашивания (Папаниколау и др.) требует влажной фиксации мазка, то сразу после получения материала мазок обрабатывают аэрозолем для фиксации или капельным фиксатором или помешают на 10 минут в 96 % спирт, после чего препарат высушивают на воздухе.
- Цитологические препараты с тканевого кусочка готовят до его обработки формалином.
- Направляемый на цитологическое исследование материал нельзя делить ни части и рассылать в разные лаборатории, т.к. характерные изменения могут быть в одной части материала и не быть в другой.
1.2.2. Получение эксфолиативного материала.
Мазки из отделяемого для цитологического исследования готовятся из клеточных элементов, которые легко слущиваются с поверхности слизистых и серозных оболочек и/или спонтанно попадают в различные выде-ления (выпоты, секреты, мокроту, патологические выделения из молочной железы, плевральный эксудат, мочу). Для приготовления препарата капля отделяемого (из молочной железы, свищей и др.) наносится на стекло и готовится мазок.
Мазки - отпечатки: к месту поражения прикладывается предметное стекло, на котором остается некоторое количество клеточных элементов и слизистого отделяемого:
- с места выделения (сосок молочной железы, выходное отверстие свита):
- со слизистой оболочки, изъязвленной поверхности слизистых и кожных покровов;
- материал с пораженного участка можно брать также с помощью ватного тампона и наносить на предметное стекло в виде отпечатков.
Мазки-отпечатки из соскоба готовятся с помощью шпателя, края предметного стекла, скальпеля: соскобы делаются осторожно с легко доступных очагов поражения, обилие слизи и некротических масс в биологическом материале препятствуют правильному приготовлению мазка, поэтому гнойные корки и некротические массы должны быть удалены.
В настоящее время появились новые технологии приготовления цитологических препаратов ("жидкостная" цитология), обеспечивающие высокую степень концентрации клеток ("Cellprint", Cytospin и т.д.). Использование "жидкостной" цитологии особенно рекомендуется при выполнении иммуноцитохимических исследований.
Цитологические препараты из осадка доставленной в лаборатории жидкости серозных полостей и содержимого кист получают путем пункции плевральной, перикардиальной, брюшной полости и кист:
в жидкость добавляют консервант, чтобы предотвратить свертывание (1 г лимоннокислого натрия на 1 л жидкости), тщательно перемешивают стеклянной палочкой.
в лабораторию доставляют всю полученную жидкость для исследования;
- если количество жидкости слишком велико (несколько литров), то жидкость отстаивают (около часа), сливают верхний слой, а отстоявшийся нижний (в пределах 1 л) доставляют в лабораторию;
1.2.3. Получение пункционного материала
Пункцию проводит врач, как правило, под контролем ультразвукового исследования, реже под контролем рентгеновского исследования. Для получения полноценного материала для цитологического исследования при проведении диагностической пункции необходимо соблюдать ряд правил:
- пункцию проводят с соблюдением правил асептики и антисептики.
- нельзя пунктировать опухоль при подозрении на меланому;
- перед проведением пункции опухоль тщательно пальпируют, определяют ее подвижность, связь с окружающими тканями и возможность оптимальной фиксации;
- игла и шприц для пункции должны быть абсолютно сухими;
- не следует проводить обследуемому анестезию пунктируемого образования (сама пункция не более болезненна, чем прокол иглой для анестезии, кроме того, применение новокаина может вызвать изменение клеточных элементов);
- мандреном, как правило не пользуются, так как используемые для диагностических пункций иглы имеют очень маленький диаметр и косой срез на конце, игла легко продвигается через ткани, расположенные над опухолью (кожу, подкожную клетчатку, мышцы), расслаивая их, закупорка иглы происходит очень редко. Однако при пункции богато васкуляризированных образований (щитовидная железа, сосудистые опухоли, кости и др.) необходимо использовать иглу с мандреном, последний извлекается после введения иглы в исследуемое образование;
- пункцию различных образований, в том числе опухолей производят тонкой иглой (наружный диаметр 0,6-0,7 мм), которая присоединяется к шприцу 20 мл.
Методика проведения пункции тонкой иглой
Опухоль фиксируют пальцами левой руки. Иглу без шприца (или с присоединенным шприцем с опущенным поршнем) вводят перпендикулярно через кожу в исследуемое образование. По достижении очага поражения осторожно пальпируют ткань вокруг введенной иглы, определяя правильность прокола; при небольшом подкожном узле можно несколько наклонить иглу, при этом опухоль на игле сместится, что ощущается пальцами и подтверждает правильное положение иглы. Не рекомендуется производить вращательные движения иглой, так как это наносит лишнюю травму и не приводит к получению более полноценного материала. После этого присоединяют шприц с опущенным поршнем (если он не был присоединен сразу) и делают 2-3 резких насасывающих движения, снимая шприц с иглы после каждого подъема поршня. По окончании взятия шприц необходимо снять, иглу извлекают без шприца, что позволяет сохранить материал; для цитологического исследования достаточно материала попавшего в просвет иглы.
Содержимое шприца выдувается на предметное стекло при помощи щприца, который наполняется воздухом и вновь соединяется с иглой. Содержимое размазывается по стеклу другим стеклом или ребром иглы. Если при проколе опухоли появляется жидкость, то под иглу подставляют пробирку и собирают жидкость. Если жидкость не стекает, можно использовать шприц, осторожно оттягивая поршень и, набирая жидкость в шприц, после чего шприц снимают и жидкость сливают в пробирку. После удаления жидкости иглу вводят в более плотную ткань пунктируемого образования и получают пунктат в просвете иглы.
1.2.4. Получение биопсийного и операционного материала.
Цитологические препараты (отпечатки и соскобы) можно делать из материала, полученного при биопсии или хирургической операции:
- отпечатки выполняются путем прикладывания стекла к биопсированному кусочку или разрезу удаленной опухоли;
- разрез опухоли или лимфатического узла необходимо проводить сухим скальпелем, чтобы избежать разрушения клеток водой;
- если консистенция ткани плотная (костная, хрящевая) и не позволяет сделать отпечатки, производят соскоб с поверхности свежего разреза опухоли (путем легкого соскабливания предметным стеклом или скальпелем).
При проведении эндоскопического обследования материал для цитологического исследования берут с помощью специальных приспособлений:
аспираты промывных вод - с помощью отсасывающего устройства,
при бронхоскопии -для приготовления мазков из бронхоальвеолярных лаважей используется технология цитоцентрифугирования (Cytospin);
мазки-отпечатки из материала щипковых биопсий, браш-биоптаты, пунктаты и др.).
Правила доставки биологического материала в лабораторию.
1. Флаконы с материалом и стекла-мазки должны иметь идентификацию (маркировку): на них должна быть четко нанесены код или фамилия больного, идентичные коду и фамилии в бланке направления материала для цитологического исследования. Для приготовления цитологических препаратов предпочтительнее использовать предметные стекла со шлифованным краем. которые легко маркируются.
2. Цитологический материал доставляют в лабораторию в ближайшие сроки после его взятия. Особенно это относится к жидкостям, мокроте, содержимому кист и любому кровянистому материалу.
3. Для доставки необходимо иметь специализированные контейнеры для предметных стекол, пробирки, чашки Петри, емкости разного объема. Не допускается контакт нативного материала, в том числе подсушенного предметного стекла с бланком - направлением.
4. Полученный материал доставляют в лабораторию с бланком-направлением, в котором должны быть представлены паспортные данные обследуемого пациента, диагноз, проведенная терапия, точно должно быть указано место участка, откуда был взят материал, и способ его получения.
5. Сотрудник лаборатории, который принимает материал, должен проверить маркировку препаратов, пробирок и т.д., оформление направления, отметить характер и количество биоматериала, число присланных мазков
Правила приготовления препаратов (мазков) из биологического материала для цитологического исследования.
Методика приготовления мазка.
Необходимой предпосылкой для точной оценки морфологических особенностей клеток в мазке является правильно сделанный, качественно фиксированный, хорошо окрашенный и методологически корректно изученный мазок, поступающий в лабораторию в сопровождении необходимых клинико-инструментальных и анамнестических данных. Невыполнение этих условий ведет к неправильному распределению клеток ткани, неполному выявлению их морфологических особенностей, "пропуску" важной диагностической информации на предметном стекле или отсутствию корригирующей клинической информации и, тем самым, к ошибочной оценке цитологической картины, а значит к неполноценному или ошибочному диагнозу. Если мазки были приготовлены вне лаборатории, то в соответствии с теми же требованиями оценивается их макроскопический вид. Сотрудники лаборатории должны постоянно обучать представителей клинических отделений, участвующих в приготовлении мазков.
Правильно приготовленный мазок из нормальной или патологически измененной ткани должен отвечать следующим условиям:
1. Мазок должен начинаться на 1 см от узкого края предметного стекла и заканчиваться примерно в 1.5 см от другого края предметного; мазок не должен достигать длинного края стекла, между мазком и краем предметного стекла должно оставаться расстояние примерно 0.3 см.
2. Хороший мазок должен быть максимально тонким (максимально приближающимся к однослойному), равномерной толщины (не волнообразным) на всем протяжении.
3. Мазок из осадка жидкого материала (жидкость из серозной полости, смыв из различных органов, содержимое кистозной полости и т.п.) должен заканчиваться у одного из узких краев предметного стекла в виде следа, оставленного как бы тонкой щеткой.
4. Клетки в мазке должны быть равномерно распределены, все участки мазка должны хорошо просматриваться и не содержать "толстые участки", содержащие непросматриваемые (плохо просматриваемые) скопления или комплексы клеток.
Правила фиксации мазка.
Фиксация мазка проводится в соответствии с методикой, обусловленной биологическим материалом, взятым для цитологического исследования (влажная фиксация биологического материала или подсушивание его на воздухе). При влажной фиксации приготовленный мазок помещается в фиксирующую жидкость, затем подсушивается на воздухе. Недостаточная фиксация мазка ведет к некачественному окрашиванию клеток.
1. Правильная фиксация мазка обусловливает стойкость клеток по отношению к содержащейся в красках воде, которая в нефиксированном мазке изменяет строение клеточных элементов. При фиксации мазка про-исходит коагуляция белка, в результате чего клетки прикрепляются к предметному стеклу;
2. При фиксации цитологических препаратов должны использоваться фиксаторы, прописи приготовления которых приводятся в соответствующих руководствах (1, 2, 3).
3. Рекомендуемые фиксаторы:
- метиловый спирт;
- этиловый спирт;
- смесь Никифорова;
- фиксатор Май-Грюнвальда;
- фиксатор Лейшмана;
- ацетон (для иммуноцитохимии).
Лучшим фиксатором является метиловый спирт, на основе которого готовят фиксатор Лейшмана и Май-Грюнвальда.
Правила окрашивания мазка.
Качественное окрашивание позволяет правильно идентифицировать клеточные элементы мазка и оценить их особенности при микроскопии. В адекватно окрашенном мазке структуры цитоплазмы, ядра, ядерного хроматина, ядрышек окрашены элективно.
1. При применении любой методики окрашивания мазка важно точно соблюдать последовательность процедур приготовления растворов и временные промежутки в течение процесса окрашивания.
2. Существующие в продаже партии красителя имеют различную интенсивность окраски. Это обязывает опытным путем установить оптимальные концентрации (разведение) и время окрашивания для каждого флакона красителя, которые устанавливают при окрашивании серии препаратов растворами с различной концентрацией красителя, меняя длительность его воздействия. При приготовлении растворов необходимо учитывать рН воды: она должна быть нейтральной (pH 6,8 -7,2), что обеспечивается использованием буферных растворов.
3. Рекомендуемые методы окрашивание цитологических мазков: - азур-эозиновый, (по Романовскому, Лейшману, Май-Грюнвальду, Панпенгейму и др.);
- гематоксилиновый;
- гематоксилин-эозиновый;
- метод Папаниколау.
4. Для уточнения диагноза рекомендуется использование цитохимических и иммуноцитохимических методов анализа в соответствии с принятыми методиками.
Эффективность использования методических указаний
Цитологические исследования являются достаточно массовым видом лабораторных диагностических исследований. В 2001 г. клинико-диагностическими лабораториями учреждений здравоохранения России было выполнено 41867,9 тыс. цитологических исследований. Клиническая цена достоверности результата каждого цитологического исследования чрезвычайно высока, принимая во внимание медицинские и этические последствия неправильного диагноза того или иного поражения, в особенности при подозрении на злокачественное новообразование. Повсеместное правильное выполнения процедур взятия образцов и подготовки мазков биологического материала должно существенно повысить точность морфологической оценки цитологических препаратов и, соответственно, диагностики опухолей и неопухолевых поражений.
Проект методических указаний рассмотрен и одобрен Центральным исполнительным советом Ассоциации клинических цитологов России.
Литература:
1. Микроскопическая техника. Руководство для врачей-лаборантов. / Под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова. - М.; Медицина, 1996; 542 с.
2. Цитологическая диагностика опухолей и предопухолевых процессов / Под ред. проф. А.С. Петровой - М.: Медицина, 1985, 304 с. 3. Wied G.L., Keebler C.M., Rosenthal D.L. et al. "Compendium on quality assurance. Proficiency testing and workload limitation in clinical cytology" -Tutorials of cytology, Chicago, Illinois. USA, 1995, 399 p.